Больные с различными формами ретинобластомы были отобраны при медико-генетическом консультировании в следующих клиниках: МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца, ВОНЦ РАМН.

Для получения ДНК из лимфоцитов периферической крови использовали венозную кровь пациентов. В качестве консерванта был использован 0.5 М раствор ЭДТА. При заборе крови в пробирку к 1 мл консерванта добавляли 10 мл крови и тщательно перемешивали.

Для получения ДНК из опухолевого материала достаточного молекулярного веса и необходимой степени чистоты использовали следующий метод выделения ДНК (Sambrook et al. 1989):

1. Ткань опухоли измельчали глазными ножницами и затем гомогенизировали, растирая со стеклом.
2. Гомогенизат переносили в пробирку и добавляли экстракционный буфер.

3. Добавляли протеиназу К до концентрации 50 мкг/мл и SDS до 0.5 %. Образец тщательно перемешивали.

4. Инкубировали 12 часов при 37^ОС.

5. Доводили объем образца до 5 мл раствором ТЕ, рН 8.0 и последовательно проводили экстракцию ДНК равными объемами фенола, смеси фенол-хлороформ и хлороформом (Маниатис и др. 1984).

6. К образцу добавляли 1/10 объема 5М ацетата натрия, рН 5,3, перемешивали и осаждали ДНК 2, 5 объемами холодного 96% этанола, выдерживали образец 30 мин. при температуре - 70^ОС.

7. Пробу центрифугировали при 0^ОС 15 мин. с ускорением 12000g. Высушивали осадок ДНК на воздухе и растворяли в 200 мкл ТЕ рН 8.0.

Выход ДНК составлял 25-50 мкг на 1 мл крови. После полного растворения ДНК на спектрофотометре измеряли ее концентрацию и снимали спектр поглощения в диапазоне от 220 до 320 нм, с целью определения чистоты ДНК. При этом проверяли выполнение следующих условий: отношение поглощения на длинах волн 230 нм/260 нм < 0.5, 260 нм /280 нм > 1.8. Максимум поглощения наблюдался в районе 260 нм.

При выделении ДНК из опухолевого материала была использована аналогичная методика (Sambrook et al. 1989).

2.4. Выделение геномной ДНК из лимфоцитов крови.

1. К 500 мкл крови добавляли дист. воду до конечного объема 1.5 мл. Тщательно перемешивали и оставляли на 15 минут.

2.Пробу центрифугировали при 4⁰С 10 минут с ускорением 5000g. Супернатант сливали.

3. Осадок отмывали 1 мл буфером 1хSSC.
4. Центрифугирование см.2.

Полимеразную цепную реакцию проводили по стандартной схеме (Saiki, 1989) при помощи программируемого термоциклера РНС-2 фирмы Тесhne с использованием термофильной ДНК-полимеразы НПО “Ферментас” г. Вильнюса.

ПЦР проводили по следующей схеме: к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 0,05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 единицы термофильной ДНК-полимеразы, в 50 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50мМ KCl, 10мМ трис-HCl pH 8,4, 1-5 мМ МСl₂, 10% DMSO, 0.005М меркаптоэтанол. Оптимальное содержание MgCl₂ в буфере подбирали экспериментальным путем для каждой пары используемых праймеров. Затем добавляли 40-60 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 95^ОС в течение 10 мин. и проводили 33 цикла с параметрами:

Для определения метилирования ДНК проводилась обработка соответствующими метилчувствительными рестриктазами HpaII или HhaI по следующей схеме: к 1500 нг геномной ДНК добавляли 3 у.е. фермента и 2 мкл соответствующего 10х буфера, доводили до 20 мкл дист. водой и оставляли на 10 часов в термостате при оптимальной для рестрикции температуре (37^ОС ).

Электрофорез проводили в 8% ПААГ при 4^ОС в течение 3-5 часов.

Окрашивание гелей проводили по усовершенствованной методике Liberman, разработанной в лаборатории. После электрофореза гель помещали в раствор 10% метанола и 5% уксусной кислоты на 10-15 минут. Затем дважды отмывали дистиллированной водой. После этого гель инкубировали в растворе 0,011 М AgNO₃ в течение 10-15 минут, трижды промывали в дистиллированной воде. Проявление проводили в модифицированном растворе проявителя (увеличена концентрация НСНО) следующего состава: 0,75 M NaOH; 0,5 M HCHO; 2,3mM Na(BH₄) около 10-15 минут, в зависимости от интенсивности проявления геля.

Полноразмерная нуклеотидная последовательность генов Rb1, CDKN2A, Ing1, Leu5 была получена из геномной базы данных Genbank NCB1.