В настоящее время представления о генетической природе развития онкологических заболеваний основаны на предположении о существовании генов-супрессоров опухолевого роста, дефект которых приводит к прогрессии, а восстановление функции к замедлению развития опухоли и онкогенов, чья экспрессия приводит к развитию опухоли. Согласно модели канцерогенеза, предложенной Кнудсеном, для инактивации генов-супрессоров опухолевого роста необходимо два события (удара) приводящих к инактивации обоих копий гена на гомологичных хромосомах. К настоящему времени модель канцерогенеза претерпела некоторые изменения, в результате чего, наряду со структурными изменениями генов-супрессоров, большое значение имеет также и функциональная инактивация, которая может иметь место в результате аномального метилирования промоторной области генов, повреждения которых приводит к озлокачествлению клетки.

Оценка функциональной активности генов проводилась методом анализа метилирования промоторной области с использованием метил-чувствительных рестриктаз и последующей полимеразной цепной реакции.

Промоторная область генов представлена CpG-островками. Это нетранслируемые регуляторные последовательности ДНК от 500 до 2000 п.о., характеризующихся высоким содержанием гуанина и цитозина (G+C>60 %). В результате метилирования цитозин, стоящий перед гуанином, превращается в метилцитозин. Следствием этого является невозможность узнавания белками и факторами транскрипции конкретной последовательности гена, что приводит к блокированию транскрипции. Метилирование CpG-островков может способствовать взаимодействию ДНК с неспецифическими ДНК-связывающими белками, которые тоже репрессируют транскрипцию. В связи с этим аномальное метилирование можно рассматривать как один из механизмов, приводящих к нарушению белок-синтезирующей функции клетки и фукциональной инактивации гена. Исследования вопроса о причинах инактивации известных генов-супрессоров показали, что в некоторых случаях нарушение работы гена связано именно с метилированием промоторной области. Понижение уровня синтеза белка или его полное отсутствие может стать причиной, приводящей клетку к опухолевой трансформации.

Гены Rb1, р16/CDKN2A относятся к семейству генов-супрессоров опухолевого роста и имеют протяженные GC-обогащенные районы ДНК. Для этих генов показано метилирование промоторной области как механизм инактивации. Гены Leu5 и Ing1 в настоящее время не достаточно охарактеризованы и исследований по характеристике их функционального статуса до настоящего времени еще не проводились.

Для исследования было взято: 7 образцов нефробластомы, 8 образцов тиреокарциномы, 8 образцов лимфоцитарной массы при хроническом лимфолейкозе, 8 образцов саркомы Юинга, 5 образцов хондросаркомы, 2 образца рака предстательной железы, 10 образцов рака молочной железы, 18 образцов меланомы, 50 образцов ретинобластомы + 26 образцов ДНК лимфоцитов больных ретинобластомой, чей опухолевый материал недоступен. Также в качестве контроля были взяты нормальные ткани: 10 образцов ДНК лимфоцитов крови, по два образца нормальной ткани почки, щитовидной железы, молочной железы и 5 образцов нормальной ткани предстательной железы.

Во всех образцах нормальных и опухолевых тканей был проведен анализ статуса метилирования промоторной области генов p16/CDKN2A, Rb1, Ing1 и Leu5. Результаты представлены в таблице 1.

Ген Rb1 является геном-супрессором опухолевого роста. Состоит из 27 экзонов и имеет CpG-богатую промоторную область. Повреждения этого гена – основная причина возникновения ретинобластомы. Самыми распространенными способами инактивации этого гена являются потеря гетерозиготности, точковые мутации, метилированием же, по данным литературы, это ген инактивируется примерно 4% случаев. Также в случае герминальной мутации гена Rb1 возникать такие опухоли как остеосаркома, лимфоклеточный лейкоз, мелкоклеточный рак легких, рак груди, опухоли половых органов. Поэтому кроме анализа метилирования промоторной области этого гена в ретинобластомах, в исследование были взяты и другие опухоли.

Был выбран участок промоторной области, внутри которого было 4 сайта узнавания рестриктазы Hpa II (CCGG). Поиск сайтов рестрикции необходимых ферментов осуществлялся с помощью программ Genepro и WIN-SUN.

Рисунок 5. Рестрикционная карта промоторной области гена Rb1.

Условия проведения амплификации:

Амплификация проходила в течение 33 циклов.

Продукт амплификации имеет длину 249 п.н.

Была проведена ПЦР участка промотоной области гена Rb1. Для визуализации продукта амплификации проведен электрофорез в 8% ПААГ с последующей окраской нитратом серебра.

Для 7 образцов ретинобластомы было показано метилирование промоторной области из 50 обследованных (рис. 6), что составило 15%. Эти данные не согласуются с данными литературы, где сообщается о том, что инактивация гена Rb1 путем метилирования происходит примерно в 4% случаев.

Также метилирование промоторной области этого гена было определено в 3 случаях нефробластомы из 7 обследованных. Хотя геном ответственным за возникновение нефробластомы считается ген Wt1, не что исключено, причиной развития такой опухоли может явиться повреждение какого-либо другого гена, например, функциональная инактивация гена Rb1 в результате метилирования промоторной области. По полученным результатам это может происходить в 40% случаев (3 из 7). Чтобы исключить неполный гидролиз ДНК по HpaII, образцы были обследованы с различными парами праймеров на промоторные области других генов

Рисунок 6. Анализ метилирования промоторной области гена Rb1 в образцах:

1 – ретинобластома 11, 2- ретинобластома 14, 3 – рак груди 8, 4 - тиреокарцинома, 5 – ткань почки, 6 – нефробластома 2. Электрофорез в 8% ПААГ.

Также нами впервые описан случай метилирования промоторной области гена Rb1 в лимфоцитах крови больного с ретинобластомой. Это является для данного гена первым подтверждением предположения о возможной роли метилирования, как первой, так и второй мутации в двух ударной теории канцерогенеза. Аномальное метилирование промоторной области гена Rb1 в ДНК лимфоцитах крови можно рассматривать как событие аналогичное герминальным делециям, приводящих к полному отсутствию одной из копий гена во всех клетках организма.

Вторым этапом работы являлось определение статуса метилирования промоторной области гена р16/CDKN2A. Это еще один широкоизвестный ген супрессор опухолевого роста принимающий участие в том же биохимическом пути регуляции клеточного цикла, что и ген Rb1. Белок р16 – ингибитор циклин-зависимых киназ cdk4/6, которые при связывании с циклином Д, осуществляют фосфорилирование белка pRB, инактивируя его в G1-S фазе клеточного цикла.

По литературным данным структурные повреждения этого гена наблюдаются при семейных случаях меланомы и синдроме диспластического невуса, а также опухолях поджелудочной железы, головы и шеи. Метилирование гена р16/CDKN2A отмечается при раке мочевого пузыря, саркомах мягких тканей, раке легкого и др.

Ген р16/CDKN2A состоит из 3-х экзонов и имеет довольно протяженную CpG-богатую промоторную область. При выборе области исследования также учитывалось наличие сайтов рестрикции для метил-чувствительных рестриктаз Hpa II (CCGG) и Hha I (GCGC). Поиск сайтов рестрикции необходимых ферментов осуществлялся с помощью программ Genepro и WIN-SUN.

Рисунок 7. Рестрикционная карта промоторной области гена p16/CDKN2A.

Амплификация проходила в течение 35 циклов.

Продукт амплификации имеет длину 349 п.н.

Рис. 8. Анализ метилирования промоторной области гена CDKN2A в образцах:

1 – ретинобластома , 2- рак простаты, 3 – тиреокарцинома,

4 – меланома 3, 5 – меланома 7. Электрофорез в 8% ПААГ.

Из всех исследуемых опухолей (таблица 1) метилирование обнаружено в 4 случаях из 18 меланомы и в 10 из 50 ретинобластомы. По данным литературы, метилирование промомторной области гена р16/CDKN2A происходит более чем в 60% случаев. В других опухолях метилирование нами не определено (рис.8). Это произошло, вероятно, потому, что в исследование было взято недостаточное количество образцов и типов опухолей.

До недавнего времени значительное количество работ было посвящено определению статуса метилирования одного гена в разных типах опухолей. Сегодня же актуально изучение опухолеобразования с точки зрения сопряженного действия различных генов, так называемый “концерт” генов при канцерогенезе.

Таким образом, в опухоли происходит больше, чем два события (удара), приводящие к инактивации пути контроля клеточного цикла, что может свидетельствовать о глубине опухолевого процесса. Но, к сожалению, по этим результатам нельзя сделать предположение о причинно-следственных взаимоотношениях генов, инактивация которых приводит к возникновению опухоли. Возможно, необходимо расширить количество исследуемых генов–участников биохимического пути контроля клеточного цикла, и попытаться связать между собой стадию развития опухолевого процесса и количество-качество событий произошедших в каждом конкретном случае развития опухоли. Скорее всего, первопричиной, приводящей к возникновению ретинобластомы, является все-таки патология гена Rb1, а уже потом повреждаются другие гены, и это может служить диагностическим маркером стадии течения опухолевого процесса.

Анализ паттерна метилирования промоторной области генов Rb1 и CDKN2A в ретинобластомах.

Олигонуклеотидные праймеры были подобраны с учетом того, чтобы внутри каждого амплифицируемого участка CpG-островка было не менее 3-4х сайтов узнавания для рестриктаз HpaII (CCGG) или HhaI (GCGC). Поиск сайтов рестрикции необходимых ферментов осуществлялся с помощью программ Genepro и WIN-SUN.

Рисунок 9. Рестрикционная карта Ing1-1a.

Рисунок 10. Рестрикционная карта Ing1-1в.

Рисунок 11. Рестрикционная карта Ing1-2.

Праймеры ПЦР: Ing1-1a rev: 5` GCAGCCCCAGTCACTCAC 3`

Ing1-1в rev: 5` CAGCCCCGCCGCATGAGAG 3`

Ing1-1в for: 5` TATTTCGCGTCGATCTCC 3`

Условия проведения амплификации:

Амплификация проходила в течение 33 циклов.

Продукты амплификации имеют длину 350, 408, 384 п.н.

Рисунок 12. Анализ метилирования промоторной области экзона 1в гена Ing1 в образцах: 1- опухоль Вильмса, 2- саркома Юинга, 3- рак груди. Электрофорез в 8% ПААГ.

ПЦР гидролизованной метил-чувствительной рестриктазой HhaI ДНК, кодирующей CpG-островок 2-го экзона гена Ing1, во всех нормальных тканях и во всех опухолях без исключения был получен положительный результат (рис. 13). В качестве негативного контроля вместо ДНК в амплификационную смесь была добавлена дистиллированная вода. 

Рисунок 13. Анализ метилирования экзона 2 гена Ing1 в образцах: 1- опухоль Вильмса, 2- саркома Юинга, 3- рак молочной железы, 4- нефробластома, 5- лимфоциты крови, 6- ткань почки, 7- ткань молочной железы, NK- негативный контроль. Электрофорез в 8% ПААГ.

Наличие у гена Leu5 большого CpG-островка длиной ~700 п.н расположенного между первым и вторым экзонами позволило предположить, что регуляция активности гена может осуществляться метилированием промоторной области. Олигонуклеотидные праймеры были подобраны к участку, внутри которого содержится 4 сайта узнавания для рестриктазы HpaII (CCGG) и 3 сайта узнавания для рестриктазы HhaI (GCGC). Поиск сайтов рестрикции необходимых ферментов осуществлялся с помощью программ Genepro и WIN-SUN.

Рисунок 14. Рестрикционная карта гена Leu5.

Праймеры ПЦР:

Условия проведения амплификации:

Амплификация проходила в течение 33 циклов.

Продукт амплификации имеет длину 296 п.н.

Ни одного случая метилирования промоторной области гена не было определено, ни в нормальных, ни в опухолевых тканях (рис. 15). В настоящее время ведется дальнейшая работа по поиску и характеристике мутаций в экзонах гена Leu5 у больных с опухолями клеток крови, а также расширяется панель опухолей для определения метилирования.

Рисунок 15. Анализ метилирования CpG-островка гена Leu5 в образцах: 1- лимфоциты, 2 – лимфоциты при хроническом лимфолейкозе, 3- саркома Юинга, 4- рак груди. Электрофорез в 8% ПААГ.

В данной работе ген Leu5 явился хорошим негативным контролем полноты гидролиза для метил-чувствительной ПЦР. В случае позитивного результата амплификации промоторной области других генов, образцы ДНК тестировались с помощью олигонуклеотидных праймеров для гена Leu5.