В настоящее время представления о генетической природе развития онкологических заболеваний основаны на предположении о существовании генов, нормальная функция которых связана с подавлением опухолевого роста. Такие гены были названы генами-супрессорами опухолевого роста (Weinbrg et al., 1991). Дефекты этих генов приводят к прогрессии, а восстановление функции – к существенному замедлению пролиферации или даже реверсии развития опухоли. Примерами генов-супрессоров служат: ген ответственный за развитие ретинобластомы - ген Rb1, два гена, отвечающие за развитие рака молочной железы - гены BRCA2 и BRCA1, также к генам-супрессорам можно отнести ген WT1 – повреждения которого приводят к нефробластоме, гены CDKN2A и CDKN2B ответственные за развитие меланомы и гематологических опухолей, и другие гены. Инактивация гена hMLH1 приводит к возникновению карциномы желудка и толстого кишечника.

Гены-супрессоры опухолевого роста можно подразделить на две большие группы по занимаемому ими месту в системе функционирования эукариотической клетки. В рамках предложенной Кинзлером и Фогельштайном концепции гены-супрессоры предложено разделять на две группы: гены первой группы получили название "хранителей клеточного цикла" (gatekeepers), а гены второй - "общего контроля" (caretakers) (Баранова, Янковский 1998). Гены - "хранители клеточного цикла" напрямую вовлечены в его регуляцию. Их белковые продукты способны сдерживать опухолевую прогрессию, ингибируя процессы, связанные с делением клетки. Дефекты "генов общего контроля" приводят к повышению нестабильности генома, увеличению частоты возникновения мутаций, и, следовательно, к повышению вероятности повреждения генов, в том числе и "хранителей клеточного цикла".

К группе “хранителей клеточного цикла” (ХКЦ) относят такие гены как RB1 (ретинобластома), WT1 (опухоль Вильмса), NF1 (нейрофиброматоз типа I), а также гены, способствующие образованию клеточных контактов, и другие. Если унаследована поврежденная копия гена ХКЦ, образование опухоли может быть инициировано соматической мутацией в неповрежденном аллеле. Поэтому в случае наследственных форм опухолей, когда имеется герминальная мутация, для начала заболевания необходимо всего одно соматическое мутационное событие - повреждение единственного функционального аллеля. Спорадические случаи возникновения опухоли того же типа требуют двух независимых мутационных событий в обоих аллелях. В итоге, для носителей мутантного аллеля вероятность развития данного типа опухоли значительно выше, чем в среднем по популяции.

При семейных случаях развития некоторых видов рака, мутация в одном из аллелей соответствующего гена ОК может быть унаследована от родителей. Для инициации опухолевого процесса требуется соматическая мутация второго аллеля, а также инактивация обоих аллелей какого-либо гена ХКЦ. Таким образом, для развития опухоли в семейном случае необходимы три независимых мутационных события. Поэтому риск развития опухоли для носителей наследственной мутации гена ОК на порядок меньше, чем риск для носителя поврежденного аллеля гена ХКЦ. Спорадические опухоли обусловлены соматическими мутациями генов ОК. Они встречаются редко и для их возникновения и развития необходимо четыре независимых мутации.

Примерами генов ОК служат гены, ответственные за развитие наследуемого неполипозного рака кишечника - гены MSH-2, MLH-1. Также к этой группе можно отнести широкоизвестный ген-супрессор - р53, мутации или делеции которого наблюдаются примерно в 50% всех злокачественных заболеваний.

Ген Rb1 расположен в проксимальном отделе длинного плеча хромосомы 13q14.1, и, занимает 180 т.п.н. геномной ДНК (Wiggs et al. 1988). Он включает промоторную область около 1,5 т.п.н. (Gill et al. 1994) и состоит из 27 экзонов. Ген RB1 кодирует мРНК длиной 4,7 тысяч нуклеотидов (Mc Gee et al. 1989), экспрессирующуюся в норме во всех клетках организма.

рRb - ядерный фосфопротеин, является негативным регулятором клеточной пролиферации. Активация белка зависит от степени его фосфорилирования и носит в клетках циклический характер (Buchkovich et al. 1989; Chen and De Caprio 1989). В нормальных клетках pRb экспрессируется на протяжении всего клеточного цикла, но белок в различной степени подвергается посттрансляционной модификации, которая регулируется путем фосфорилирования и дефосфорилирования с помощью циклин-зависимых РБ-киназ и фосфатаз. Слабое фосфорилирование происходит в G_O и в G₁ фазах клеточного цикла, тогда как полное фосфорилирование белка осуществляется киназами на границе перехода G₁ в S стадию клеточного цикла. Белок рRb активен только в слабофосфорилированном состоянии (Ladlow et al. 1989; Buchovich et al. 1989; De Caprio et al. 1989). В нефосфорилированном или гиперфосфорилированном состоянии белок рRb не активен, т.е. не может связяться с фактором транскрипции E2F. Анализ фосфорилирования pRb in vitro и in vivo показал, что фосфорилирование pRb в ходе клеточного цикла способны осуществлять активированные протеинкиназы р33^cdk2, p34^cdk4 и p34^cdk2.

Продукт гена Rb1 регулирует экспрессию различных клеточных генов, контролирующих рост клеток (рис. 1). В активном гипофосфорилированном состоянии белок Rb способен связывать фактор инициации транскрипции E2F (Dyson 1998), который является регулятором транскрипции большого числа клеточных генов (например: ДНК полимераза II, DHFR – дигидрофолатредуктаза, р19), ответственных за пролиферацию. В комплексе с pRb этот фактор не способен связываться с промоторной областью генов в результате чего происходит ингибирование транскрипции и задержка клетки в G₁ фазе клеточного цикла (Сhellapan et al. 1991). Фосфорилирование pRb на этом этапе осуществляется циклин-зависимыми киназами cdk4 и cdk6, связанными с D-циклином. Белок р16/Ink4A ингибирует связывание циклинов D-типа с киназами cdk4/6, контролируя, таким образом, переход клетки из фазы G1 в фазу S.

В вирустрансформированных клетках C-концевая область pRb способна формировать специфические комплексы с трансформирующими белками некоторых ДНК-содержащих онкогенных вирусов, включая большой Т клеточный антиген вируса SV40, белки аденовируса E1A и человеческого вируса папилломы E7 (De Caprio et al. 1988; Whyte et al. 1988; Dyson et al. 1989; Munger et al. 1989). Эти белки являются факторами, активирующими промоторы генов-регуляторов клеточной пролиферации: c-myc, N-myc, ELF1, PU1, c-myb и ряда других генов. Экспрессия протоонкогенов в нормальной клетке необходима для инициирования клеточной пролиферации и начало их работы приходится как раз на G_о® G₁ стадии цикла. Продукт гена Rb1 является негативным регулятором экспрессии этих генов (Pientenpol et al. 1990; Robbins et al. 1990).

В 1999 опубликован ряд работ (Struhl et al., Bremh and Kouzaridies) в которых показано участие белка RB в деацетилировании белков. Белок RB может связываться с двумя белками HDAC (histone deacetilase) семейства – HDAC1 и HDAC2. Luo (1999) используя метод иммунопреципитации (CHIP) показали, что статус ацетилирования гистонов изменяется после связывания с pRB. В эксперименте in vitro показано, что во время G0 и G1 фазы клеточного цикла формируется тройной комплекс состоящий из фактора транскрипции E2F, белка RB, активированной деацетилазы (HDAC1), а также других транскрипционных факторов (рис. 2). HDAC1 воздействует на нуклеосомы окружающие промоторные области генов, активных в S фазу, и препятствует их ацетилированию. Это влияние индуцирует изменение конформационной структуры компонентов хроматина, и формируется, так называемая, “закрытая” форма хроматина, что вызывает инактивацию транскрипции.

Сначала был идентифицирован ген р16, как ингибитор циклин-зависимых киназ, точковые мутации которого были определены в случае семейной меланомы и также показаны гомозиготные делеции в разнообразных опухолевых клетках. Позже в этом же локусе был идентифицирован и второй транскрипт – р19/ARF (ARF – alternate reading frame – альтернативная рамка считывания). Этот ген кодирует регулятор клеточного цикла, предотвращающий деградацию белка р53.

На молекулярном уровне действие белка р16 основано на ингибировании регуляторов клеточного цикла. Белок р16 – ингибитор циклин-зависимых киназ и является участником биохимического пути Rb/cyclinD/cdk4/p16^INK4a (Dyson and Balmain 1999). р16 связывается с киназами cdk4/6, и этот комплекс нарушает взаимодействие киназ с циклином Д (Rosso et al. 1998). Ингибирование функций циклин-зависимых киназ приводит к гипофосфорилированию белка RB, что уменьшает экспрессию E2F-зависимых генов, блокируется переход клетки из фазы G1 в фазу S (Koh et al. 1995, Serrano et al. 1996, Lukas et al 1995) и осуществляется контроль клеточного деления и пролиферации (рис. 1).

Белок р19^ARF у человека состоит из 132 аминокислот и имеет молекулярную массу 14 КДа. Этот же белок у мышей состоит из 169 аминокислот и не имеется никакой гомологии с другими мышиными белками. Молекулярная масса этого белка составляет 19 КДа.

Функция р19 состоит в том, что в активированном состоянии этот белок ингибирует фактор MDM2, который является фактором связывания белка р53 с убиквитином, что предотвращает его деградацию. Активация р19 происходит в ответ на действие таких онкогенных стимулов как E1A, ras, myc, V-abl, E2F-1. Онкогенный белок ras является одной из причин преждевременного старения фибробластов эмбрионов мышей, а myc и E1A – стимулируют апоптоз. Показано, что эти онкогены обеспечивают активацию p19^ARF/p53/MDM2 пути, который запускается при иммортализации клеток грызунов in vitro (de Stanchina et al. 1998, Zindy et al. 1998, Palmero et al. 1998).

Гены BRCA1 и 2 являются также генами-супрессорами опухолевого роста и относятся к группе "генов общего контроля". Эти гены отвечают за развитие некоторых форм рака молочной железы. Мутации одного из этих генов (BRCA1) наблюдаются в 5-10% всех опухолей данного типа, однако, в их фенотипическом проявлении имеются некоторые различия. Так, мутации BRCA2 (но не BRCA1) связаны с повышенным риском развития рака молочной железы у мужчин, а для носителей аберрантного аллеля BRCA1 значительно повышена вероятность развития рака яичников и в меньшей степени раков простаты и кишечника (Ford et al. 1994). Продукты обоих генов способны взаимодействовать с белком RAD51 (Scully et al. 1997, Sharan et al. 1997), являющимся гомологом бактериального белка RecA, основного белка системы репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Для продуктов BRCA1 и RAD51 показана совместная локализация в составе синаптонемальных комплексов мейотических хромосом. Эмбриональные и трофобластные клетки, дефектные по экспрессии BRCA2, сверхчувствительны к ионизирующей радиации. Эти данные говорят о том, что нарушения репарационного пути BRCA/RAD51 могут вести к увеличению нестабильности генома.

Не исключено, что мутации генов BRCA1 и BRCA2 могут приводить к образованию опухолей не только описанным выше путем. Оба белка достаточно велики – 1863 аминокислотных остатков в продукте гена BRCA1 и 3418 – в BRCA2 и могут содержать домены, нужные для выполнения других функций, не связанных с репарацией ДНК. Так, найдена гомология между третьим экзоном гена BRCA2 и активационным доменом c-Jun, содержащим сайт для JNK-киназы (Milner et al. 1997). Способность этого домена белка BRCA1 к активации транскрипции подтверждена экспериментально (Milner et al. 1997). Не менее важно, что происходящая в пределах третьего экзона замена Tyr на Cys, приводящая к нарушению способности активировать транскрипцию, наблюдалась в нескольких семейных случаях развития рака молочной железы. По соседству с активационным доменом в белке BRCA2 расположены два домена, способных ингибировать активаторную функцию этого белка. Подобный тип регуляции показан для нескольких транскрипционных факторов, в том числе для белка c-Fos. Возможно, что в случае этого белка его транскрипционная активность запускается после его стимуляции с помощью JNK-подобной киназы. Домен, способный к активации транскрипции, содержится и в составе BRCA1 (Chapman, Varo et al. 1996). Обнаружено также связывание белка BRCA1 in vivo с ранее неизвестным белком BARD1, содержащим, как и BRCA1, обогащенный цистеином RING-домен. Миссенс-мутации, выявленные в некоторых семейных случаях развития рака молочной железы, нарушают это взаимодействие, что говорит о том, что белок BARD1 также может быть вовлечен в опухолевый процесс (Wu et al. 1996).

Белок р53, функционирующий в виде тетрамера, связывается с убиквитином (Ub) при участии фактора MDM2 (murine double minute 2) и подвергается деградации (рис. 3). Белок р19/ARF, экспрессия которого увеличивается под действием онкостимулами типа E1a, V-abl, myc, нарушает это связывание и предотвращает деградацию р53. Также ингибитором этого связывания является продукт гена АТМ, повреждения которого вызывают атаксию-телангиоэктазию.

Повышенный интерес к генам-супрессорам опухолевого роста стимулировал разработку методов их направленного поиска. Ген ING1, кодирующий ядерный белок с молекулярной массой 33 кД (Garkavtsev et al., 1996), был одним из первых генов, обнаруженных методом вычитательной гибридизации с последующим отбором и клонированием фрагментов с трансформирующей активностью. Выборочный анализ клеточных линий показал, что 3’-участок гена ING1 перестроен или содержит делеции в нейробластомной линии SK-N-SH, а содержание белка p33^ING1 снижено в культурах, полученных из злокачественных клеток от больных раком молочной железы (Garkavtsev et al., 1996). Эти данные подтверждали предполагаемую принадлежность гена к супрессорам опухолевого роста.

За первой статьей, посвященной гену ING1, последовал целый ряд работ, уточнявших роль белкового продукта гена в клетке и механизмы его действия. Было показано, что ING1, как и некоторые другие гены-супрессоры, участвует в регуляции апоптоза - программируемой клеточной гибели (Helbing 1997). Так, увеличение уровня экспрессии р33/ING1 в полученной из клеток тератокарциномы линии р19, наблюдается при сывороточном голодании, индуцирующем апоптоз. Гиперэкспрессия р33/ING1 в клеточной линии р19 и фибробластах грызунов, содержащих тетрациклин-зависимый ген с-myc, заметно усиливает Myc-зависимый апоптоз. Напротив, конститутивная экспрессия антисмысловой мРНК гена ING1 препятствует апоптозу в этих клетках. Таким образом, потеря геном ING1 своей функции приводит к клеточной пролиферации и развитию опухоли вследствие сниженной чувствительности к сигналам апоптоза.

Сходство функций продуктов генов ING1 и р53 - гена-супрессора опухолевого роста, определяющего клеточный ответ на разные типы стресса (Gottlieb and Oren 1996) - заставило предположить их принадлежность одному сигнальному пути, что и было подтверждено в работе И. Гаркавцева с сотрудниками (Garkavtsev et al., 1998). Как выяснилось, биологические эффекты этих белков скоррелированы и требуют активности обоих генов: ни один из них не способен подавлять клеточный рост в одиночку, при инактивации другого. Это объясняется экспериментально обнаруженной зависимостью активации транскрипции с промотора p21/WAF1, ключевого механизма р53-зависимого контроля клеточного роста, от экспрессии ING1. Кроме того, при иммунопреципитации белки p33/Ing1 и p53 могут быть осаждены в составе единого комплекса, что говорит об их непосредственном взаимодействии. Как с помощью FISH-гибридизации (Garkavtsev et al., 1997), так и с помощью ПЦР-скрининга панели радиационных гибридов Stanford G3 (Zeremski et al., 1997), ген ING1 локализован в субтеломерном районе длинного плеча 13-й хромосомы (13q34), изменения которого были зарегистрированы при разных видах рака (Stanbridge 1992). Отчасти высокая частота перестроек длинного плеча 13-й хромосомы объясняется расположением на нем двух генов-онкосупрессоров RB1 и BRCA2 (районы 13q14 и 13q12 соответственно) (Hinds and Weinberg 1994; Wooster et al.,1994). Но в ряде случаев, например, в большой группе чешуйчатоклеточных карцином головы и шеи, перестройки не затрагивали генов RB1 и BRCA2, а потеря гетерозиготности наблюдалась в субтеломерном районе 13-й хромосомы, где расположен ген ING1 (Maestro et al. 1996).

За относительно короткое время появились данные по мутационному статусу гена ING1 и по степени его экспрессии в различных типах опухолей. Показано, в частности, что перестройки субтеломерного района длинного плеча 13-й хромосомы, сопровождающие чешуйчатоклеточные карциномы головы и шеи, не затрагивают ING1 (Sanchez-Cespedes et al., 2000). На 452 образцах карцином молочной железы был проведен мутационный и экспрессионный анализ гена ING1 (Jager et al., 1999; Toyama et al. 1999). Установлено, что мутирует он очень редко, а вот заметное (в 2 - 10 раз по сравнению с нормальной тканью) снижение его экспрессии наблюдалось в 44% опухолей и в 10 из 10 исследованных клеточных линий. Более того, большинство опухолей (58%) со сниженной экспрессией ING1 давали метастазы в лимфоузлы, в то время как среди опухолей с повышенной экспрессией гена таких было только 9%. Анализ экспрессии гена ING1 при раке желудка выявил ее значительное снижение в 15 из 20 исследованных случаев. Из 12 клеточных линии точковые мутации были обнаружены только в одной (Oki et al., 1999). Аналогичная ситуация наблюдалась и в случае глиом (Shinouraet al., 1999), Т- и В-клеточных лейкозов (Ohmori et al., 1999) и карцином прямой кишки (Sarela et al., 1999): для них показано общее снижение экспрессии гена ING1 при наличие обоих аллелей гена и отсутствии точечных мутаций и делеций. Это предполагает снижение экспрессии гена за счет транскрипционных и посттранскрипционных механизмов.

Анализ нуклеотидной последовательности геномного локуса ING1, в том числе прилегающих к экзонам интронных последовательностей, а также нетранскрибируемых последовательностей, предшествующих экзонам 1a и 1b, показал, что локус ING1 отличается необычно высоким содержанием нуклеотидов G и С. Каждому из трех экзонов ING1 сопутствует выраженный CpG-островок (рис. 4), содержащий множество участков, не распознаваемых метил-чусвтвительными эндонуклеазами рестрикции. GpC-островок экзона 1b размером по крайней мере 933 н.п. содержит 68% C и G, отношение CG к GC составляет 0,99. CpG-островок, включающий экзон 1a и предшествующая ему последовательность содержит 57% C и G, экзон 2 содержит CpG-островок с 59% C и G. Наличие CpG островков может указывать на возможности регуляции экспрессии ING1 путем метилирования ДНК de novo. Выше предполагаемых начальных позиций экзонов 1a и 1b выявлены элементы Sp1 и NF-E2, связывающие соответствующие белки и защищающие ДНК от метилирования.

Работы по поиску гена-супрессора, утрачиваемого или повреждаемого при В-ХЛЛ начались в 1994 г. В 1997 г. были выделены два перекрывающихся клона кДНК (CLL2 и CLL5), представляющих собой кодирующую область нового гена человека, получившего название Leu5. С помощью гибридизации по Саузерну было обнаружено, что кодирующаяя область этого гена расположена на расстоянии около 60 т.п.н. от границы минимального участка утрачиваемого у больных с В-ХЛЛ. Ген Leu5 кодирует белок в высокой степени гомологичный известным белкам человека, вовлеченным в процессы канцерогенеза, эмбриогенеза и регуляцию иммунного ответа.

Потеря гетерозиготности – частное событие, происходящее в опухоли; может быть вызвано делецией участка или полной потерей хромосомы.

Согласно 2-х ударной модели канцерогенеза, предложенной Knudson в 1971 году, предполагается, что для перехода нормальной клетки в опухолевую необходимо два последовательных мутационных события. Первым событием является мутация, приводящая к образованию клетки, которая обладает повышенным риском возникновения опухоли. Такие мутации могут возникать как в соматических, так и в половых клетках. Вторым событием, происходящим в соматической клетке, является мутация в неповрежденном аллеле или потеря гетерозиготности гена и, затем, превращение клетки в злокачественную. Примером могут служить случаи потери гетерозиготности (ПГ) локуса 11р15 при нефробластоме (Reev et al. 1989), а также ПГ локуса 9р21 в случае меланомы (Healy et al 1995), ПГ локуса 1р36 при нейробластоме (Fong et al. 1989) и ПГ локуса 8р21-12 при раке простаты (Trapman et al. 1994). Анализ потери гетерозиготности в опухолях, развивающихся при достаточно редком аутосомно-доминантном заболевании (1 на 100 тыс.) – туберозном склерозе, показал, что теряются маркеры, расположенные в коротком плече хромосомы 16p13.3 (чаще) и в длинном плече хромосомы 9q34 (реже) (Carbonara 1996). Во всех опухолях у пациентов с синдромом Горлина и в спорадических базально-клеточных карциномах обнаруживается ПГ по маркерам района хромосомы 9q22.3 (Levanat 1996). Исследование ПГ гена Rb1 (локус 13q14.1) в ретинобластомах по двум внегенным и одному внутригенному маркерам показало ПГ в 70% случаев (Бабенко 2000).

По типу изменения в нуклеотидной последовательности выделяют мутации сдвига рамки считывания, приводящие либо к образованию бессмысленного белка, либо к преждевременному окончанию его синтеза, и нонсенс-мутации, представляющие собой замены нуклеотидов, при которых образуются терминирующие кодоны, с наибольшим повреждающим действием. Мутации сдвига рамки считывания возникают вследствие делеции или инсерции, некратные трем нуклеотидам. Проявление таких мутаций зависит от их локализации. Чем ближе мутации к началу гена, то есть к началу транскрипции, тем короче их белковые продукты, которые не способны к модификациям и быстро деградируют. 77% всех мутаций гена АТМ и 64% мутаций гена BRCA1 являются мутациями сдвига рамки считывания. Основным типом мутаций выявляемых в гене Rb1 являются нонсенс-мутации, такие же мутации определены в генах р53 (7%) (Hussain and Harris 1998). Семейный аденоматозный полипоз желудочно-кишечного тракта - аутосомно-доминантное заболевание, вызываемое мутациями в гене APC. Вариантом заболевания является синдром Гарднера, при котором преимущественно поражается толстый кишечник. При заболевании достаточно часто выявляются гепатобластомы, опухоли щитовидной железы, медуллобластомы, фибромы и другие опухоли (Gorlin 1960). Основным типом мутаций являются делеции и нонсенс-мутации, приводящие к преждевременной терминации синтеза белка. Герминальные мутации преимущественно повреждают первую половину гена, причем обнаружено два “горячих” кодона - 1061 и 1309. Мутации последнего кодона приводят к раннему появлению полипов и быстрому их озлокачествлению. Соматические мутации в основном локализуются в районе кодонов 1286-1513, с преимущественным повреждением кодонов 1309 и 1450 (Beroud 1996, . Lamlum 1999, Wallis 1999).

Различные изменения в нуклеотидной последовательности транскрибируемых областей ДНК могут по-разному проявляться в фенотипе. Часть из них не оказывает никакого влияния на структуру и функцию соответствующего белка. Примером могут служить замены нуклеотидов, не приводящие к замене аминокислот в силу вырожденности генетического кода. Такие замены принято называть полиморфизмами (или в иностранной литературе – silence mutation). Но не всегда полиморфизмы так “невинны”. Так Siegelmann и Buetow (1998) сообщают о замене гуанина (G) на аденин (A) в кодоне кодирующем валин (Val)80 в гене ароматазы (Cyp 19) кодирующем цитохром Р450. Этот полиморфизм является маркером предрасположенности развития рака груди у женщин. Полиморфизм ДНК в еще одном цитохроме - P450c17a (CYP17), участвующим в биосинтезе стероидных половых гормонов, так же может повышать риск возникновения рака молочной железы. В 5’ области гена в позиции -27 выявлена однонуклеотидная замена T->C, которая создает сайт узнавания для фермента MspAI и транскрипционного фактора Sp1. Показано, что этот аллель влияет на экспрессию гена и увеличивает риск возникновения рака груди в 2,5 раза (Feigelson 1996, 1998)

Большинство мутаций, затрагивающих регуляторные области, выявляют в промоторной части генов, где они изменяют консервативные последовательности. Этот тип мутаций остается пока наименее изученным и, возможно, часть не выявляемых в ряде патологий мутаций относится к этому типу. Мутации, затрагивающие регуляторные области генов сопровождаются, как правило, количественными изменениями соответствующего продукта и не затрагивают структуры и функциональной активности белка. Проявление таких мутаций определяется пороговым уровнем концентрации белка, при котором его функция еще сохраняется. Как правило, регуляторные мутации менее серьезны и обладают более выраженным плейотропным эффектом по сравнению с мутациями структурных генов.

Суть метилирования заключается в том, что это - химическая модификация, катализируемая ферментом, которая добавляет метильные (CH₃) группы на специфические сайты белков, ДНК и РНК. Реакция ДНК метилирования катализируется ферментом ДНК-метилтрансферазой, который осуществляет перенос метильной группы (CH₃) с S-аденозилметионина на цитозин, стоящий перед гуанином. У человека и большинства млекопитающих ДНК метилирование – естественная модификация ДНК, и воздействует только на основание цитозин (С), стоящий перед гуанином (G), т. е. метилирование происходит только в CpG-динуклеотидах. У растений 5-метилцитозин можно обнаружить в динуклеотидах CG и тринуклеотидах CNG (Т-С, А или Т). 70-80% всех CpG-динуклеотидов в человеческом геноме метилированы. Однако в нормальной ткани метилирование происходит, прежде всего, в областях, где плотность CpG динуклеотидов низка, и большинство CpG-островков в норме полностью неметилированы. Но есть исключения из этого правила: метилированные промоторные области генов на инактивированной Х хромосоме, например, ген FMR1 (Li et al 1993, Singer-Sam et al. 1993) и импринтированные гены. Так экспрессия таких генов как IGF2, SNRPN, Znf-21, Par-5 идет только с отцовской хромосомы, а генов WT1, Mash2, p57 – только с материнской (Vogelstein et Kinzler ). Также профиль метилирования может меняться в течение жизни организма. Некоторые гены, экспрессирующиеся в эмбриональном периоде, перестают функционировать к моменту рождения особи. А для таких генов как E-CAD и DBCCR1 показано метилирование в нормальных тканях по мере старения организма.

Первые два гена, для которых было показано аберрантное метилирование, были кальцитонин и MyoD (Jones 1990). Функциональное значение этого явления ранее было неясно, поскольку оба гена не экспрессируются в большинстве тканей. Открытие привело к гипотезе, что метилирование промотора может быть одним из механизмов инактивации генов-супрессоров опухолевого роста в раковых клетках. Предположение было вскоре подтверждено обнаружением метилирования промоторной области известных генов-супрессоров опухолевого роста типа RB1, VHL и p16 в спорадических опухолях. В настоящее время список генов, инактивирующихся метилированием промоторной области, пополняется. Так было показано аномальное биаллельное метилирование промотора гена Н19 у пациентов с опухолью Вильмса. Также показано метилирование промоторной района р16 во многих типах опухолей (Myohanen et al. 1998, Huschtscha et al. 1998, Yao et al. 1998, Gonzalo et al. 1998, Esteller et al. 1999). В гепатокарциномах и аденокарциномах поджелудочной железы инактивация гена таким способом происходит почти в 70% случаев (Wilents et al 1998). Гиперметилирование промоторной области рецептора эстрогена (ER) обнаруживается в опухолях толстого кишечника (Issa et al. 1994). Транскрипционный фактор (MYOD), специфичный для мышечной ткани, гиперметилируется не только при раке мочевого пузыря, но и при раке толстого кишечника. Недавно клонированный ген N33, подвергается метилированию в том же типе опухолей, как и два других гена (ER и MYOD), более чем в 90% случаев (Ahuja et al. 1998). Тканевой ингибитор металлопротеиназы-3 (TIM-3) может подавлять рост опухоли, ангиогенез, прорастание и метастазирование (Cambers 1997). Показано, что аберрантное метилирование промоторного района этого гена происходит в различных опухолях: при немелкоклеточном раке легкого в 19%, раке молочной железы в 27%, раке толстой кишки в 27%, карциноме почки в 78% и глиобластоме в 26% случаев (Bachman 1999). В спорадических опухолях молочной железы обнаруживают инактивацию посредством метилирования генов BRCA1, MYOD и ER (Dobrovic et al. 1997, Ahuja 1998, Lapidus 1998). Таким образом, метилирование промоторной области может являться новым механизмом инактивации генов-супрессоров опухолевого роста.

Роль метилирования ДНК в генезе опухолей была изучена на примере гена MНL1, который ответственен за развитие рака желудочно-кишечного тракта. В клетках опухоли выявляется большое количество генетических изменений - микросателлитные маркеры представлены одновременно многими разными аллелями, дополнительными к двум родительским аллелям. Это явление получило название “нестабильности микросателлитов” (MSI) (Tibodeau et al., 1993) или “репликационных ошибок” (Aaltonen et al., 1993). Этот ген имеет гиперметилированный промоторный район. Обработка клеток опухоли метилтрансферазой, ингибирующей 5-аза-2’-деоксицитидин (5-azad-2’-C) приводила к деметилированию промотора MHL1, выработке MHL1 белка и восстановлению активности гена, вследствие чего опухоль претерпевала обратное развитие. Таким образом, было установлено, что гиперметилирование CpG-островков является ведущим в механизме инактивации MHL1.